În anul 1552, în plin august, se termina construcția ultimei biserici înălțate de Doamna Elena Rareș. Biserica ”Ospenia” – cum se numea atunci – a fost zidită, din piatră și cărămidă, cu acoperiș de draniță. La poartă, era amplasată o clopotniță de lemn, aproape de maidanul unde poposeau carele cu mărfuri în drum spre Polonia. E foarte posibil ca pe locul bisericii de piatră a ”Ospeniei” să fi existat, anterior, o bisericuță de lemn.
S-a vorbit despre o perioadă nefastă a bisericii, ce ar fi stat pustie din 1655 până în 1725 reintrând în viața socială a orașului în 1759. În acest an Ioan Callimah Voievod a dat hrisovul care avea să fie ”actul de naștere” al școlii de la Uspenia. După încetarea activității acestei școli, la care au predat preoți și psalți de la Biserica ”Ospenia”, orașul a rămas iar fără școală, fapt ce l-a determinat pe domnul Mihail Șuțu să emită un nou hrisov, pe 30 septembrie 1793 – de reînființare a unei școli cu dascăl elinesc, care să-i ajute pe ”ucenicii săraci și iubitori de învățătură care vor răzbi la acea școală” .
Incendiul ce a cuprins centrul orașului în 1810 a afectat și Biserica ”Ospenia”. Situația fiind tragică, botoșănenii au cerut domnului Mihail Șuțu, nepotul celuilalt Mihail Șuțu, sprijin pentru reînființarea școlii. Un nou hrisov dat la 5 martie 1820, de domnul de mai sus, hotăra reînființarea școlii și ajutarea ei.
După moartea lui Mihail Șuțu și înăbușirea Eteriei în 1821, turcii au urmărit și pedepsit toți grecii considerați eteriști. Epitropii greci ai ”Ospeniei” s-au făcut nevăzuți cu tot cu fondurile destinate reparațiilor, iar o ceată de turci răzleți au pătruns în Biserica ”Ospenia” și au jefuit-o de toate odoarele de aur și argint. După toate peripețiile din acei ani tulburi, Școala Domnească s-a mutat în curtea Bisericii Sf. Dimitrie, în 1832 înființându-se la Botoșani prima școală primară de stat.
Incendiul devastator din 1887 a distrus centrul orașului și a afectat grav biserica.
În același secol, în 1872, s-a instalat primul ornic public în clopotniță, loc de unde se semnalau și incendiile . Mai târziu, epitropia bisericii a cerut Primăriei orașului Botoșani înființarea unui cor, care avea să se reunească oficial abia în 1900.
La 21 ianuarie 1850, la ”Uspenia” a avut loc botezul lui Mihai Eminescu, preotul Ion Stamate – ce a oficiat slujba religioasă – fiind duhovnicul familiei Eminovici, ce locuia nu departe de catedrală. Biserica ”Uspenia” a păstrat singurul act de stare civilă a marelui poet, mai exact registrul de botez în care se arăta nașterea poetului – 15 ianuarie 1850 - și data botezului – 21 ianuarie 1850. Registrul a fost luat de Nicolae Iorga, împreună cu alte 21 de documente, și dus la Academia Română în 1925.
În decursul timpului, Biserica ”Uspenia” a suferit o sumă întreagă de transformări. Voievodul Mihail Racoviță face o primă restaurare, între anii 1724 și 1725.
În 1810, un incendiu mistuitor afectează grav și Biserica ”Uspenia. În anul 1819 se termină lucrarea de zidărie pentru clopotnița alipită de corpul bisericii.
Au urmat o noi restaurări în 1877, 1888 – 1889, 1905, 1912, 1916 – 1921, 1935 – 1936, 1963 – 1964, 1989 – 1995.
Catapeteasma bisericii este, probabil, cea făcută în timpul renovării de către domnul Moldovei I. Mihail Racoviță – în anul 1725 – ea fiind, la fel de probabil, refăcută după marele incendiu din 1810. După vandalizarea bisericii de către turci, în 1821, s-a impus repictarea icoanelor împărătești, ele fiind finalizate, în 1829, de către Vasile Mihail Zugrav.
Preoți slujitori: Pr.Ion Stamati – slujitor la Uspenia și protopop al județului Botoșani – este cel care l-a botezat pe Mihai Eminescu la 21 ianuarie 1850; în 1887 era preot la Uspenia, Vasile Lăzărescu; iconom stavrofor Vasile Pavelescu ( 1912 și 1921) ; Cristofor Manoilescu și cu preotul Gheorghe Gheorghiu; diaconul Gheorghe Lungu – ce a slujit între anii 1936 – 1967; preotul Dimitrie Grigoraș: 1964 – 1967; preotul Petru Tănasă, preotul Gheorghe Andrișescu: 1985 – 1989; preotul Vasile Acatrinei:1989 – 1995; preotul Mihai Popa: 1989 – 1998; preotul Toader Candrea – 1998 până în prezent.
